马卡斯亮蓝溶液使用(考马斯亮蓝G)
1.考马斯亮蓝G
考马斯亮蓝与蛋白质结合是一个很快的过程，约2 min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1 h。之后，蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀出来。一般在反应5min后开始测定。
选用的标准品预先用凯氏定氮法准确测得蛋白纯度，然后根据需要，用NaCl溶液或蒸馏水配制成标准溶液（含标准蛋白100μg/mL）。
最好用去离子水配制试剂。
先将考马斯亮蓝配制成母液（低温下可长期放置），工作液要现用现配。都避光、低温保存。
做标准曲线时，其回归方程的相关系数应达到3个9（即r值至少为0.999），标准曲线方可用。试剂或仪器更换，一定重新做标准曲线。
测定样品的条件一定要与做标准曲线的条件相一致。
蛋白糖化物对考马斯亮蓝法存在干扰，因此，应用考马斯亮蓝法测定含糖基蛋白的制品时需进一步改进。
去污剂（如 Triton X-100、SDS）,Tris,NaOH，植物样品中的酚类、有机酸等，是常见的干扰物。
试验中所需器皿一定要干净、干燥，各试液取量一定要准确。
2.考马斯亮蓝法测蛋白浓度,具体步骤有哪些,需要什么试剂
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1.Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95%乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2.标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3.将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（最好用PBS）。
4.按1:5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5.每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5~30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min.
6.根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：
考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍
三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作
（一）、试剂：
1、考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以1号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm
1、
2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图 ，测出回归线性方程。即A595nm=a*X( )+6
一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：
1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。
