1、将电源插头插入220V电源插座内。将探笔插入仪器上的探笔插孔内。
2、将电源开关拨向开,计数池内灯亮。同时显示窗内显示明亮的,表示允许进行计数。
3、将待检的培养皿底朝上放入计数池内。用探笔在培养皿底面对所有的菌落逐个点数。此时,菌落处被标上颜色,显示窗内数字自动累加。
4、用放大镜仔细检查,确认点数无遗漏,计数即已完毕。
5、显示窗内的数字即为该培养皿内的菌落数。
6、记录数字后取出培养皿。按复按钮,显示恢复,为另一培养皿的计数做好准备。
原发布者:jxc2520
食品微生物学检验菌落总数测定一、培养基和试剂1、平板计数琼脂(platecountagar,PCA)培养基成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.0±0.2制法:将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。分装试管或锥形瓶,121℃高压灭菌15min。2、磷酸盐缓冲液成分磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g蒸馏水500mLpH7.2制法:贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。3、无菌生理盐水成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mL制法:称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。二、操作步骤样品的稀释1、固体和半固体样品:称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:10的样品匀液。2、液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量
统计菌落数目的方法有直接计数法 和间接计数法两种。
1. 直接计数法
直接计数法是将稀释的样品滴在计 数板上,盖上盖玻片,然后在显微镜下计 数4〜5个中格的细菌数,并求出每个小 格所含细菌的平均数,再按公式求出每 毫升样品中所含的细菌数。计算公式 为:每毫升原液所含细菌数=每小格平 均细菌数X400X1 000X稀释倍数。这 种方法的优点是所需设备比较简单,能 迅速得到结果,而且在计数的同时还可 以观察到所研究的微生物的形态特征; 缺点是不能区分死菌与活菌。
2. 间接计数法
在应用稀释涂布平板法计数时,首 先要将待测样品配制成均匀的系列稀释 液,尽量使微生物细胞分散开,再把稀释 液接种到平板上,进行培养观察。但值 得注意的是,统计的菌落数往往比活菌 的实际数目低,而且统计的结果一般用 菌落数而不用活菌数来表示。计算公式 为:每克样品中的菌落数= (C+V)X M,其中,C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V表示涂布平板时所 用的稀释液的体积(mL),M代表稀释 倍数。
微生物计数方法:
1. 血细胞计数法
将稀释的菌液样品滴在血细胞计数板上,在显微镜下计算4~5个中格的细菌数,并求出每个小格所含细菌的平均数,再以此为依据,估算总菌数。
①此法的缺点是不能区分死菌和活菌。
②对压在小方格界线上的细菌,应当取平均值计数。
③此法可用于测定培养液中酵母菌种群数量的变化
2. 稀释涂布平板法
每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落.培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌.
①这一方法常用来统计样品中活菌的数目
②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,原因是当两个活多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落.因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示.
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定.但不适于测定样品中丝状体微生物,例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等.
④此法若不培养成菌落,可通过将一定量的菌液均匀地涂布在玻片上的一定面积上,经固定染色后在显微镜下计数,这样又称涂片计数法.染色可用台盼蓝,台盼蓝能使死细胞染成蓝色,可分别计数死细胞和活细胞.
3. 滤膜法
滤膜法是当样品中菌数很低时,可将一定体积的湖水、海水或饮用水灯样品通过膜过滤器.然后将滤膜干燥、染色,并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上(或一定面积上)的细菌数.
此法也可以通过培养观察形成的菌落数来推算样品中的菌数.例如测定饮用水中大肠杆菌的数目:将已知体积的水过滤后,将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养.在该培养基上大肠杆菌的菌落呈现黑色,可根据培养基上黑色菌落的数目,计算出水样中大肠杆菌的数目.
此法也是统计样品中活菌的数目.
4. 比浊法
在一定范围内,菌是悬液中细胞浓度与混浊度成正比,即与光密度成正比,菌越多,光密度越大.因此可借助与分光光度计,在一定波长下,测定菌悬液的光密度,以光密度表示菌量.实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内,否则不准确.
5. 显微镜直接计数法
在课本生物选修1生物技术实践P22中“除了上述活菌计数法外,显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法.”这里说的显微镜直接计数,我认为应该是在稀释涂布的基础上不培养成菌落而通过染色的方法在显微镜下直接计数.再如滤膜法也一样,可以有两种情况.
另外,微生物计数法发展迅速,多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法可以用来统计微生物的数目
微生物计数:
病毒以外的微生物的计数。样品中可测到总的(死的和活的)细胞数,称为总细胞数,样品中可测到的活的细胞数称活细胞数。
总细胞数可用电子仪器或直接计数法测定。含有低细胞浓度的液体样品。可以用膜过滤并在膜上对细胞染色,在显微镜下计数活细胞数的侧定。可由:(1)在计数室内测定用活体染色剂染色的样品,(2)稀释平板法,(3)菌落计数,样品中活细胞数目由接种了样品的,发育在适合培养基上的菌落数目推定。培养基和(或)培养条件的选择,可以极大地影响形成菌落的活细胞数。某些类型的细胞,趋向于丛生或链生,这些微生物的准确的活细胞计数不能用上述方法,可依据“单位体积菌落形成单位,(cotony-formingunit/ valwne)来计数。 上述方法,一般适用于大部分细菌和泡子计数,其中一些方法,'可用于某些藻类、真菌和原生动物。在显微镜下,计数迅速运动的原生动物,可以用粘性悬浮培养基,如2-5I甲基纤维素。降低它们的运动逮度。
统计菌落数目的方法有直接计数法 和间接计数法两种。
1. 直接计数法直接计数法是将稀释的样品滴在计 数板上,盖上盖玻片,然后在显微镜下计 数4〜5个中格的细菌数,并求出每个小 格所含细菌的平均数,再按公式求出每 毫升样品中所含的细菌数。计算公式 为:每毫升原液所含细菌数=每小格平 均细菌数X400X1 000X稀释倍数。
这 种方法的优点是所需设备比较简单,能 迅速得到结果,而且在计数的同时还可 以观察到所研究的微生物的形态特征; 缺点是不能区分死菌与活菌。2. 间接计数法在应用稀释涂布平板法计数时,首 先要将待测样品配制成均匀的系列稀释 液,尽量使微生物细胞分散开,再把稀释 液接种到平板上,进行培养观察。
但值 得注意的是,统计的菌落数往往比活菌 的实际数目低,而且统计的结果一般用 菌落数而不用活菌数来表示。计算公式 为:每克样品中的菌落数= (C+V)X M,其中,C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V表示涂布平板时所 用的稀释液的体积(mL),M代表稀释 倍数。
测定微生物细胞数目的方法有很多,介绍几种1.血细胞计数法将稀释的菌液样品滴在血细胞计数板上,在显微镜下计算4~5个中格的细菌数,并求出每个小格所含细菌的平均数,再以此为依据,估算总菌数。
①此法的缺点是不能区分死菌和活菌。②对压在小方格界线上的细菌,应当取平均值计数。
③此法可用于测定培养液中酵母菌种群数量的变化2.稀释涂布平板法原理:每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。
①这一方法常用来统计样品中活菌的数目②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低,原因是当两个活多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。因此统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
③土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物,例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。
④此法若不培养成菌落,可通过将一定量的菌液均匀地涂布在玻片上的一定面积上,经固定染色后在显微镜下计数,这样又称涂片计数法。染色可用台盼蓝,台盼蓝能使死细胞染成蓝色,可分别计数死细胞和活细胞。
3.滤膜法 滤膜法是当样品中菌数很低时,可将一定体积的湖水、海水或饮用水灯样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色,并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上(或一定面积上)的细菌数。
此法也可以通过培养观察形成的菌落数来推算样品中的菌数。例如测定饮用水中大肠杆菌的数目:将已知体积的水过滤后,将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养。
在该培养基上大肠杆菌的菌落呈现黑色,可根据培养基上黑色菌落的数目,计算出水样中大肠杆菌的数目。此法也是统计样品中活菌的数目。
4.比浊法原理是在一定范围内,菌是悬液中细胞浓度与混浊度成正比,即与光密度成正比,菌越多,光密度越大。因此可借助与分光光度计,在一定波长下,测定菌悬液的光密度,以光密度表示菌量。
实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内,否则不准确。 5.显微镜直接计数法在课本生物选修1生物技术实践P22中“除了上述活菌计数法外,显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。”
这里说的显微镜直接计数,我认为应该是在稀释涂布的基础上不培养成菌落而通过染色的方法在显微镜下直接计数。再如滤膜法也一样,可以有两种情况。
另外,微生物计数法发展迅速,多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法可以用来统计微生物的数目。
微生物的显微直接计数法
一、实验目的
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法,掌握显微镜下直接计数的技能。
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多,通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图21-1),计数区的刻度有两种:一种是计数区分为16个大方格(大方格用三线隔开),而每个大方格又分成25个小方格;另一种是一个计数区分成25个大方格(大方格之间用双线分开),而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造,它们都有一个共同特点,即计数区都由400个小方格组成。
计数区边长为1mm,则计数区的面积为l mm2,每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后,计数区的高度为0.1mm,所以每个计数区的体积为0.1mm3,每个小方格的体积为1/4000mm3。
使用血球计数板计数时,先要测定每个小方格中微生物的数量,再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。
已知:1mm3体积=10 mm*10 mm*10 mm= 1000mm3
所以:1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4*106个小方格,即系数K=4*106 。
因此:每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数(N)*系数(K)*菌液稀释倍数(d)
三、实验器材
1.活材料:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面或培养液。
2.器材:显微镜、血球计数板、盖玻片(22mm*22mm)、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四、实验方法
1.视待测菌悬液浓度,加无菌水适当稀释(斜面一般稀释到10-2),以每小格的菌数可数为度。
2.取洁净的血球计数板一块,在计数区上盖上一块盖玻片。
3.将酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取少许,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴(不宜过多),让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区,勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上,不要使计数区两边平台沾上菌悬液,以免加盖盖玻片后,造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。4.静置片刻,将血球计数板置载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近,观察时应减弱光照的强度。
5.计数时若计数区是由16个大方格组成,按对角线方位,数左上、左下、右上、右下的4个大方格(即100小格)的菌数。如果是25个大方格组成的计数区,除数上述四个大方格外,还需数中央l个大方格的菌数(即80个小格)。如菌体位于大方格的双线上,计数时则数上线不数下线,数左线不数右线,以减少误差。
6.对于出芽的酵母菌,芽体达到母细胞大小一半时,即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次(每次数值不应相差过大,否则应重新操作),求出每一个小格中细胞平均数(N),按公式计算出每ml(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。
7.测数完毕,取下盖玻片,用水将血球计数板冲洗干净,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干,放入盒内保存。
五、实验作业:
将实验结果填入下表中:
计数次数 每个大方格菌数 稀 释
倍 数 试管斜面中的总菌数 平均值
1 2 3 4 5
第一次
第二次
现在随着科技的进步,菌落计数技术日趋完善。主要体现在配置越来越高,功能越来越全。计数的速度越来越快,准确性也越来越高。所以,价格也就节节攀升。一般对于精确度要求不高的用户,可以考虑手动的或者半自动的菌落计数器。手动的价格比较便宜,市场价大约都在800-1200元,稍微好点的,是半自动的带有语音读报功能的,放大倍数在3级以上的,市场价要2500元左右,这种已经能够满足大多数用户的计数要求。较高配置的全自动计数器,多用在微生物实验室里,像素主要有300万,900万和1000万三个规格。软件方面添加了很多分析功能,价格也在3-8万。进口的菌落计数器主要来自三个国家,德国、英国和法国的。就相同功能的半自动仪器,国产的和进口的价格相差大概在2-3倍。全自动的价格也相差一倍之多。需求者应该充分考虑自己的需求侧重点和预算进行选购。
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