1、凯氏定氮法
凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下,用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐,然后在碱性条件下将铵盐转化为氨,随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收,再以标准盐酸滴定,就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定,可由其氮量计算蛋白质含量,故此法是经典的蛋白质定量方法。
优点:可用于所有食品的蛋白质分析中;操作相对比较简单;实验费用较低;结果准确,是一种测定蛋白质的经典方法;用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质。
缺点:凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。
2、双缩脲法
双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液,呈蓝色,由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时(多肽),试液中的铜与多肽配位,配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度,在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
优点:测定速度较快,干扰物质少,不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点:①灵敏度差; ② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。
3、酚试剂法
取6支试管分别标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,不加标准蛋白溶液,在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。
优点:灵敏度高,对水溶性蛋白质含量的测定很有效。
缺点:①费时,要精确控制操作时间;②酚法试剂的配制比较繁琐。
4、紫外吸收法
大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收,这是由于蛋白质中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于测定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。
取9支试管分别标号,前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液,1号试管不加标准蛋白溶液,最后一支试管加待测蛋白质溶液,而不加标准蛋白溶液,每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致,将液体混合均匀,在280nm波长处进行比色,记录吸光度值。
优点:简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后能回收。
缺点:①测定蛋白质含量的准确度较差,专一性差; ②干扰物质多,若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。
5、考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后,其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。
在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下,当溶液中的蛋白质浓度不同时,就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式,而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况,当溶液中的蛋白质浓度增加时,显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加,因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
优点:灵敏度高,测定快速、简便,干扰物质少,不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响,适合大量样品的测定。
缺点:由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
参考资料来源:百度百科-蛋白质测定
定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。
考马斯亮蓝法(Bradford法)。 凯氏定氮 灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为 ±2% 费时 8~10小时 将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定 非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离) 用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长 双缩脲法(Biuret法) 灵敏度低 1~20mg 中速 20~30分钟 多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物 硫酸铵;Tris缓冲液;某些氨基酸 用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏 50~100mg 快速 5~10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶; Folin-酚试剂法(Lowry法) 灵敏度高 ~5mg 慢速 40~60分钟 双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵;Tris缓冲液;甘氨酸; 各种硫醇 耗费时间长;操作要严格计时;颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高 1~5mg 快速5~15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液; SDS 最好的方法;干扰物质少;颜色稳定; 颜色深浅随不同蛋白质变化。
一、凯氏(kjeldahl)定氮法
优点: 用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少优点
①可用于所有食品的蛋白质分析中;
②操作相对比较简单;
③实验费用较低;
④结果准确,是一种测定蛋白质的经典方法;
⑤用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质
缺点
①最终测定的是总有机氮,而不只是蛋白质氮;
②实验时间太长(至少需要2h才能完成);
③精度差,精度低于双缩脲法;
④所用试剂有腐蚀性.
灵敏度低 适用于0.2-1.0mg氮 干扰物质 :非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离) ;费时太长
二 Folin-酚试剂法
优点:操作简便,灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,样品中蛋白质含量高于5μg即可测得,是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。
缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
三、Bradford法的突出优点是:
(1)灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是:
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。
(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
四 紫外吸收法
优点:简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如生化制备中常用的(nh4)2so4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值。
缺点:测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质,有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进行计算的方法,加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的,虽然经过校正,测定的结果还是存在一定的误差。
五、双缩脲法(Biuret法)
优点:较快速,干扰物质少,不同蛋白质显色相似
缺点:不太灵敏
①凯氏定氮法 原理:蛋白质平均含氮量为16%。
当样品与浓硫酸共热,蛋白氮转化为铵盐,在强碱性条件下将氨蒸出,用加有指示剂的硼酸吸收,最后用标准酸滴定硼酸,通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。 ②双缩脲法 原理:尿素在180℃下脱氨生成双缩脲,在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。
蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键,故多肽、蛋白质等都有双缩脲(biuret)反应,产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点:灵敏度低,样品必须可溶,在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg),且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰,但 准确度 较高,不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry) Folin酚法是biuret 法的延伸,所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂(碱性铜试剂),试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下,蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+, Cu+能定量地与Folin-酚试剂反应生成蓝色物质,600nm比色测定蛋白质含量。 灵敏度较高(约 0.1 mg),但较麻烦,也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。
步骤中各项试剂的混合,要特别注意均匀澈底,否则会有大误差。 ④紫外法 280nm光吸收法:利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法:若样品液中有少量核酸共存按下式计算: 蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 (280 260为角标) ⑤色素结合法(Bradford 法) 直接测定法:利用蛋白质与色素分子(Coomassie Brilliant Blue G-250)结合物的光吸收用分光光度法进行测定。 考马斯亮兰(CBG)染色法测定蛋白质含量。
CBG 有点像指示剂,会在不同的酸碱度下变色;在酸性下是茶色,在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候,因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境,因此会变成蓝色。
当样本中的蛋白质越多,吸到蛋白质上的CBG也多,蓝色也会增强。因此,蓝色的呈色强度,是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法:蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素,以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法 BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4'-二羧-2,2'-二喹啉)法与Lowry法相似,主要差别在碱性溶液中,蛋白质使Cu2+转变Cu+后,进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色,在波长562 nm有强的吸收。 它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定,因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。
灵敏度Lowry法相似。 本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度,较不受干扰,但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法 胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶,呈洋红色,具有高电子密度,并能与多种生物大分子结合。 胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色,颜色的改变与蛋白质有定量关系,可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法 有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团,如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团,可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉),则可追踪该金属。
1.根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等.透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法.透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离.超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程.这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开.它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小.所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法.当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开.例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3].使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度.密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低.蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白.凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一.凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等.在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1].凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]. 2.根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等.但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的.常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等. 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法.每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最 低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解.因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质.王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%.李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来.等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取.李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8.他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%.另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]. 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析.应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10].盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产.由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性.为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]. 有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质.例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢。
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