(1)液相法:先将同位素标记的C1q与灭活过的血清标本混合作用,再加入0.5%(终浓度)的PEG将结合了C1q的CIC沉淀下来,通过检测沉淀物中的放射活性来计算CIC的含量。
(2)固相法:先将C1q吸附于固相载体表面,加入待检血清使CIC与C1q结合,再加入同位标记的或酶标记的抗人IgG或SPA,最后检测其放射活性或酶活性。 (3)C1q偏离试验:先将同位素标记的C1q与灭活的血清标本混合,再加抗体致敏的绵羊红细胞,温育后离心,检测红细胞上的放射活性。
红细胞的放射活性与免疫复合物的量呈负相关。
补体测定 第一节 补体的性质与活化途径 一、补体的性质 补体(complement,C):是一组存在于人和脊椎动物(vertebrates)血清及组织液中具有酶样活性、不耐热和功能上连续反应的糖蛋白,是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件,故称为补体。
补体系统的功能:广泛参与机体的抗感染防御反应,介导细胞溶解,调理吞噬,免疫黏附,参与炎症反应引起机体免疫损伤等 补体按其性质与功能分为三类,即 • ①补体系统的固有成分,共9种,按先后次序分别命名为C1-C9 ②调节和控制补体系统活化的成分,多以其功能命名,如C1抑制物 ③补体受体(CR),以其结合对象来命名 二、补体的活化途径 经典途径 替代途径 MBL途径 (一)补体激活的经典途径 是以IgG(1,2,3)或IgM类抗体结合抗原后的免疫复合物为主要激活剂,激活过程从C1q开始,补体C1~C9共11种成分全部参与的活化途径。二)补体激活的替代途径 补体激活的替代途径又称旁路途径,与经典途径不同之处在于激活与抗原体复合物 无关,是非特异性的,没有c1,c4和c2参与,直接激活c3,完成c5~c9的激活过程 血清总补体活性测定(CH50试验) (一)实验原理 补体最主要的活性是溶细胞作用,这种活性很容易通过溶血反应进行检测。
在一个适当的、稳定的反应系统中,溶血反应对补体的剂量依赖呈一个特殊的S形曲线。在轻微溶血和接近完全溶血时,补体量的变化不能使溶血程度有显著改变,即溶血对补体量的变化不敏感。
但在半溶血(50%溶血)上下时曲线最陡,即使补体含量仅有较小变动时,溶血程度也会发生较大的改变,也就是说对补体量的变化非常敏感。故采用50%溶血作为终点指标要比100%溶血敏感得多,这一方法称为补体50%溶血(complement hemolysis 50%),简称为CH50。
二)试验方法1、绵羊RBC:浓度一般为2%~5%2、溶血素:即抗绵羊RBC抗体,试验前应在56℃加热30min或60 ℃加热30min以灭活补体3、稀释缓冲液:磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液4、50%溶血标准管:5、取新鲜血清标本进行试验。按的要求在各管中加入试剂和反应物,一起放37℃水浴箱中温育30min。
温育后将所有试管2500r/min离心5min,通过观察比较,选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上分别读取吸光度,以最接近标准管的那一管定为最高有效反应管,取其稀释倍数代入下列公式,求得CH50的测定值(单位U)。每毫升血清总补体活性(单位)= 1/血清用量*稀释倍数 三)方法评价 CH50试验测定的是经典途径总补体溶血活性,所反应的是补体9种成分的综合水平。
方法简便、快速,但敏感性低,补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外,还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、SRBC数量和反应温度有一定关系。钙镁离子可稳定溶血系统,但过量反而抑制溶血反应。
单个补体成分的测定 一、免疫溶血法 二、免疫化学法 补体结合试验 补体结合试验(complement fixation test,CFT)是用免疫溶血机制做指示系统,来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断,即著名的华氏反应。
这一传统的试验经不断改进,除了用于传染病诊断和流行病学调查以外,在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。一、试验原理 该试验中有5种成分参与反应,分属于3个系统: ①反应系统,即已知的抗原(或抗体)与待测的抗体(或抗原);②补体系统;③指示系统,即SRBC与相应溶血素,试验时常将其预先结合在一起,形成致敏红细胞。
反应系统与指示系统争夺补体系统,先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。二、试验方法 补体结合试验的改良方法较多,较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法(塑板法)等。
目前以后两种方法应用较为广泛,因为可以节省抗原,血清标本用量较少,特异性也较好。以下叙述以小量法为例,即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml,补体加0.2ml,总量为0.6ml。
(一)试剂1.抗原:试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯,纯度愈高,特异性愈强。如使用粗制抗原时,须经同样处理的正常组织作抗原对照,以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2.抗原和抗本的滴定:补体结合试验中,抗原与抗体按一定比例结合,因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定,选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应(100%不溶血)的最高稀释度作为抗原和抗体的效价(单位)。
3、补体的滴定:一般用豚鼠补体,补体滴定9逐步加入各试剂,温育后观察最少量补体能产生完全溶血者,确定为1个实用单位,正式试验中使用2个实用单位。(二)血清标本 采集血液标本后及时分离血清,及时检验或将血清保存于-20℃。
血清在试验前应先加热56℃30min(或60℃3min)以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一:①加热提高12 ℃ ;②-20℃冻融后离心去沉淀;③以3mmol/L盐酸处理;④加入少量补体后再加热灭活;⑤以白陶土处理;⑥通入CO2;⑦以小白鼠肝粉处理;⑧用含10%新鲜鸡蛋。
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