细胞检测的方法(检测细胞增殖的方法)
1.检测细胞增殖的方法有哪些
一、MTT比色：
MTT比色是一种目前被广泛采用的检测细胞生长和存活的方法，其原理是外源性MTT（四唑盐）可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成难溶的蓝紫色结晶物并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能，DMSO（二甲基亚砜）能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联检测仪在490nm波长处检测其光密度值，可间接反映活细胞数量。在一定范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比，此方法已广泛用于检测细胞活力、观察细胞生长等方面，具有灵敏度高、重复性好、操作简便、经济、快速、易自动化、无放射性污染等特点，与细胞计数有良好的相关性。
二、rdU标记法
1.细胞以1.5*105/ml细胞数接种于直径35ml培养皿中（内放置一盖玻片），培养1天，用含0.4% FCS培养液同步化3天，使绝大多数细胞处于G0期。
2.终止细胞培养前，加入BrdU（终浓度为30μg/L）,37℃，孵育40min。
3.弃培养液，玻片用PBS洗涤3次。
4.甲醇/醋酸固定10min。
5.经固定的玻片空气干燥，0.3%H2O2-甲醇30min灭活内源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封闭。
7.甲酰胺100℃，5min变性核酸。
8.冰浴冷却后PBS洗涤，加1抗即抗小鼠BrdU单抗（工作浓度1:50），阴性对照加PBS或血清。
9.按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数，计算标记指数（LI）。
三、结晶紫法
1.体外细胞培养结束后，去培养液，加入11%的戊二醛固定，置于振荡器上摇20min。
2.固定细胞用去离子水洗涤至戊二醛液洗净。
3.置空气或烘箱37℃彻底干燥。
4.加入0.1%的结晶紫液对细胞染色，振摇30min。
5.用蒸馏水洗涤，至多余的结晶紫液冲洗干净。
6.置空气或37℃烘箱中彻底干燥。
7.加入10%的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取。
8.1h后在酶标仪上测定光吸收度，波长595nm。
四、酸性磷酸酶法
1.96孔细胞培养板中培养细胞，去培养液。用0.01mol/L PBS洗涤1次（如为悬浮细胞则用离心洗涤）。
2.去洗涤液后加入磷酸酶底物100μl/孔。
3.37℃，孵育1~4h。
4.加入0.1mol/L氢氧化钠10μl/孔。
5.在多孔酶标仪上405nm处测光吸收度，将细胞培养板其中不含细胞，同样处理过的一孔作为空白对照，所测的每孔光吸收度可间接反应每孔中的细胞数。如在同样条件下作一细胞数的系列标准对照，以细胞数为X轴，光吸收度为Y轴，可作直线回归，可推算出每孔中的细胞。
2.细胞免疫功能检测常用有哪几种方法
细胞免疫（CMⅠ）是由多种细胞相互作用的结果。
免疫细胞间相互作用导致多种细胞因子的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定，因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂，且很难标准化。
一、迟发型过敏反应的体外检测方法皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。
1.皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24~48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。
2.接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱生接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导至DTH反应。
在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7~10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。
二、细胞免疫的体外检测方法体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。
仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%,B细胞占4%~10%，其作为非DT、非B细胞。1.T细胞计数（1）E花环法：人类T细胞表面有SRBC受体（CD2）能与SRBC结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合，经37℃培养5~10分钟放4℃过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%~80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。
目前此方法已用来分离T细胞，而不用做T细胞计数。（2）用单克隆抗体计数T细胞：将人的PBM分成三等份，分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体作第二抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3 细胞即总T细胞。
正常人在PBM中T细胞占70%~80%。正常人的CD4 细胞和CD8 细胞之和应与CD3 细胞数一致。
CD4 细胞与CD8 细胞的比值正常人约为2/1而艾滋病患者则比值小于1.7。2.T细胞活化试验 T细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。
T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。
最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为MTT检测法，MTT是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲（fromazan）产物。该产物的多少与活性细胞数正相关。
结果可用酶标检测仪（595mm）测量汇丰银行密度，做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数。
3.细胞毒试验 TC细胞、NK细胞、LAK细胞、TIL细胞对其靶细胞有直接的细胞毒（杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51Cr-Na2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合，于37℃培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，即可得到51Cr标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与51Cr标记的靶细胞混合（比例约为50:1或100:1）靶细胞被杀伤越多，释放到上清液中的液游离的51Cr越多，且不能被其他细胞吸收。
用γ射线测量仪检测上清液中的cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全，及经IgG介导的ADCC效应，或NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用是有意义的。
4.混合淋巴细胞的反应（MIR） 是体外研究T细胞的较好的方法，双向MLR常被用来筛选骨髓移植的供体。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养4~5天，在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。
或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合（靶细胞来自与刺激细胞相同的个体）如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞，可杀死活的细胞，根据靶细胞释放51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子）和LIF（白细胞移动抑制因子）来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的免疫酶技术，操作简单，并能定量以取代了MIF和LIF的测定。
单个核细胞与分裂原。
3.检测细胞凋亡的方法有哪些
一、形态学观察方法 1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
二、DNA凝胶电泳 （一）检测原理 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180-200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
（二）结果判断 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 （一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体； 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合； 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合； 5、加酶的底物，测光吸收制。
（二）用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。
该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。 四、流式细胞仪分析 （一）检测原理 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。
利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 （二）应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点： 1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2）、可以做许多相关性分析 3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。 ■DNA片断原位标记法 凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate,DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3.的羟基（-OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。
DNA片段原位标记法有二种： 1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT）技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3-OH端 2、原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL为合适。
■检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法 1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。
因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
2、结果判断：正常活细胞Annexin V 、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。 3、应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。
又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是最为理想的检测细胞凋亡的方法。
4.细胞活力测定的方法有哪些
根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重，如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。
除了干重、湿重反映细胞物质重量外，还可以通过测定细胞中蛋白质或DNA的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分，含量也比较稳定，其中氮是蛋白质的重要组成元素。
从一定体积的样品中分离出细胞，洗涤后，按凯氏定氮法测出总氮量。蛋白质含氮量为16%，细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50%一80%，一般以65%为代表，有些细菌则只占13%一14%，这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。
因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：蛋白质总量=含氮量*6.25核酸DNA是微生物的重要遗传物质，每个细菌的DNA含量相当恒定，平均为8.4*`10^(-5)`NG。因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取DNA，求得DNA含量，再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。
5.免疫学的检测方法有哪些
免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫。
体液免疫：
所谓体液免疫，即以B细胞产生抗体来达到保护目的的免疫机制。负责体液免疫的细胞是B细胞。体液免疫的抗原多为相对分子质量在10,000以上的蛋白质和多糖大分子，病毒颗粒和细菌表面都带有不同的抗原，所以都能引起体液免疫。
临床上一个反复发作的化脓感染，常使医生想到患者是否有免疫缺陷病，一般原发免疫缺陷发病年龄很小，而继发免疫缺陷病人多在30岁以上。绝大多数免疫缺陷病人多表现为体液和细胞免疫同时受损，所以应全面检查这两方面的功能。遗憾的是，目前应用的检测方法的局限性，其结果常难以得出明确结论。
细胞免疫：
T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞（也叫效应T细胞），当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。
在抗感染免疫中，细胞免疫主要参与对胞内寄生的病原微生物的免疫应答及对肿瘤细胞的免疫应答，参与迟发型变态反应和自身免疫病的形成，参与移植排斥反应及对体液免疫的调节。也可以说，在抗感染免疫中，细胞免疫既是抗感染免疫的主要力量，参与免疫防护；又是导致免疫病理的重要因素。
6.细胞凋亡常用的检测方法有哪些
1 光学显微镜和倒置显微镜
(1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
(2) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割
成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
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7.细胞活性检测的方法有多少种
细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H 放射性同位素掺入法、MTT 法等。
其中 MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但 MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的 Formazan ，故有时重复性略差。
为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如 XTT 、CCK-8 ( WST-8 )等。
