植物rna反转录合成cdna(反转录酶的注意事项)
1.反转录酶的注意事项有哪些?
反转录酶在进行RT反应之前，应考虑以下几个方面：1、RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA，高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
在提取RNA的过程中，要特别防止RNase的污染，同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。 RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。
蛋白RNase抑制剂仅防止RNaseA,B,C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase，实验过程中经常更换新手套。 2、引物的选择OligodT选择OligodT时，要求RNA必须有PolyA，所以真核生物的mRNA都适用。
适合长链甚至全长mRNA的RT，所以对RNA样品的质量要求较高，最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应，建议推荐使用OligodT引物。
使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。随机引物适合各种RNA的RT，尤其适合模板丰度很低的情况（比如某个gene表达量很低）。
选择随机引物时，第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板，然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。 同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系，一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng，如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng，可能会导致小片段产物（。
2.RNA是如何反转录成cDNA的
操作步骤是先加RNA、OligodT、随即引物、水
65C反应10min，冰上放置5min后：这一步是让RNA变性，把RNA的二级结构打开；
再加dNTP,RNaseA,BUFFER,
MTV逆转录酶，
反应25℃10min：这一步是让反转录引物（oligodT，随机引物）和模板RNA退火结合
37℃60min：这一步是反转录酶的工作温度
70℃10min：这一步是变性，把合成的cDNA和RNA变性开，就拿到单链的cDNA
3.反转录的cdna电泳应该是怎样的
RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的
是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作：
一、cDNA第二链的合成：
1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂（promega）:
20ul 10*DNA Polymerase I buffer
6ul 10mM dNTP（自己配制）
xul dd H2O
1ul RNase H(2U/ul)
10ul DNA Polymerase I(10U/ul)
总体系为200ul;
2. 混匀后，16℃反应2.5小时；
3. 70℃灭活10分钟；
4. 反应完成后，得到200ul cDNA第二链反应体系，将此体系置于冰上；
5.取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
