pcr实时荧光结果分析(实时荧光定量PCR具体实验步骤是什么)

1.实时荧光定量PCR具体实验步骤是什么

变性→退火→延伸三个基本反应步骤，答：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。我们实验室用BIOG 染料法荧光定量PCR和BIOG探针法荧光定量PCR测得的扩增曲线起跳值一般在30左右，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

2.荧光定PCR中的注意事项

影响荧光PCR的因素很多，但从操作和技术上来讲应该要注意一下几点：

1. RNA的完整性

因为RNA一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA的量，所得的结果也是错误的。所以在RNA提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA酶的污染。

2. RNA样品中的基因组DNA污染

提取的RNA样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA对试验有两个影响：一是影响对RNA的精确定量；二是影响PCR扩增的特异性。

3. PCR反应体系的优化

PCR扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物，为此，首先要保证PCR反应体系达到最优。目前许多公司都有用于实时定量PCR反应的试剂盒，可以方便PCR反应的操作。

4. 反转录

反转录所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量，反转录对于实时定量PCR来说是非常关键的一步。目前常用的反转录酶有2种：AMV-RT和MMLV-R。反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT和特异引物。相比之下Oligo-dT和特异性引物更适合实时定量PCR。

5.利用实时定量PCR研究基因表达时，一般用相对定量的方法相对定量必须用到内标基因。可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因。常用的内标基因有β-tublin、actin、

GAPDH、18sRNA、efla和Cyclophilin等。尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定，但是

最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化。也就是说并不是任何内标基因都适合

任何试验。在选择内标基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内标基因或内标基因组合。