ip免疫共沉淀(请教做过免疫共沉淀的高手们谈谈该方法和用途)

1.请教做过免疫共沉淀的高手们谈谈该方法和用途

飞秒检测发现免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

2.什么是免疫共沉淀

免疫共沉淀基于抗原抗体特异性结合的原理，体外验证两种分子之间是否存在相互作用的技术。它是免疫沉淀的延伸。基本原理是在含有已知抗原的细胞裂解液中，将已知抗原作为靶蛋白，检测裂解液中可能存在与之有相互作用的蛋白。加入特定的抗体以及Protein A-Beads，会形成“抗原-抗体-Protein A-Beads”的复合物。在抗原抗体特异性结合沉淀靶蛋白的同时，存在相互作用的蛋白也能被沉淀下来，最终得到“蛋白-蛋白”的复合物。验证是否有相互作用蛋白的存在。

免疫沉淀与免疫共沉淀实验原理及方法大致相似，所不同的是在免疫共沉淀中对靶蛋白的结合由另一个与之发生相互作用的蛋白所替代。因此实验属于IP还是Co-IP取决于实验的目标是目的抗原还是相互作用蛋白质。