1、必须在无菌无尘环境下进行操作;
2、检测人员必须通过国家临检中心业务培训并取得合格证书;
3、必须拥有标准的的PCR荧光实验室;
4、后PCR区PCR完成以后,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。
扩展资料
PCR实验特点:
1、灵敏度高:PCR实验产物的生成量是以指数方式增加的,能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU;在细菌学中最小检出率为3个细菌。
2、简便、快速:PCR实验反应一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。
3、纯度要求低:不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
参考资料来源:百度百科-PCR实验室
PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
酶切分析: 根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究。 分子杂交:分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交: 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研。
斑点杂交: 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。 温度与时间的设置: 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意: 1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套; 2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染; 3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。
若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面; 4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度; 5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管; 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性; 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区; 8. 重复实验,验证结果,慎下结论。
首先,在设计PCR引物时,结构要好,长度应在20bp左右,避免引物间形成引物二聚体。
两条引物的退火温度尽量保持一致,最好是在55度左右。其次,使用的DNA模板量是比较关键的,应使用纯度较高,基因组较完全,没有产生断链的基因组DNA。
然后是PCR体系中各个试剂的使用,比如说酶的纯度,活性,并且要注意酶量一定要适中,过尤不及。各DNTP的量要保持一致。
PCRbuffer中要注意有无添加镁离子等帮助反应进行的东西。等等。
最后是PCR程序的设置。如果怕一开始就使用一个固定的退火温度扩增不出来,可以先小批量得试验温度梯度,或者用touchdown程序,即先设置一个较高的退火温度,这样引物的特异性结合会比较好,然后每个循环的退火温度都比上个循环低0.5度或1度,最终停留在某一个较合适的温度完成整个程序。
PCR反应中有太多细节要注意了。只能在试验中摸索,进步。
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1. 引物的质量是保证PCR特异性的关键,引物过长或过短均会使特异性降低,以18~30bp为宜;引物中C+G含量宜在50%左右;引物内部和引物之间不应含有互补序列;引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%;引物的3'末端与模板DNA一定要配对,但末端没有严格的限制,故引物设计时可在5'末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等;引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”;引物的终浓度一般为0.2~0.5μmol/L,过低会影响反应产量,过高会增加引物二聚或错配的几率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性,但无3'-5'外切酶活性,因此对单核苷酸的错配无校正功能,发生碱基错配的几率为 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶,而Pfu DNA聚合酶经基因工程改造后,新创出的Pfu Ultra具有更佳的校验活力。数据显示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的1/3,为Taq DNA聚合酶的1/18,是目前保真度最高的PCR酶(保真度=1/错误率) (数据来源:美国冷泉港实验室)。
3. Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感,Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合,不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度,一般以比 dNTP总浓度高出0.5~1.0mmol/L为宜,Mg2+过量能增加非特异扩增。
4. dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率,使反应特异性下降;过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制,均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。
5. 温度循环参数中应特别注意复性温度,它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度,通过Tm=4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。
6. 减低污染的常规措施:①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置;②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性;③使用阳性和阴性对照;④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂;⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存,每个包装仅用于单次实验;⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套;⑦实验前一定要认真清洁加样器等。
PCR操作注意事项:
1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600*g离心30-60分钟。
预期产量:1mg组织或1*106细胞提取RNA分别为:
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg,骨骼肌和脑组织1-1.5μg,胎盘1-4μg,上皮细胞8-15μg,成纤维细胞5-7μg
首先,要确定你的模板DNA的浓度大概是多少,太稀和太浓都影响PCR结果,具体数据不记得了,只是我自己跑PCR时因为浓度问题失败了很多次,通过多次调整浓度才得到较理想的结果。
其次,如果是自己提的DNA,要确保模板中没有酒精(提DNA最后一步,一定要等酒精挥发完才能加TE)
最重要的是要探索一个好的退火温度,退火温度的高低可以以0.5℃的梯度变化确定,假如参考值为61℃,先跑一次,看结果,如果拖尾很长,则一个一个梯度增加退火温度,但不能增得太急,我那时次增加5℃,结果跑出来全是很小很小的片段,大概都只有300bp了。
这是我跑PCR的一些经验,仅供参考
1. PCR引物设计: 引物设计可能是PCR扩增成功最关键的因素。
如引物设计欠佳,可能导致扩增产物不足,甚至扩增失败,其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体,此又成为PCR反应的竞争性产物,从而进一步抑制PCR产物形成。 在引物设计时必须考虑以下几个因素,其中最重要的是引物长度、溶解温度(Tm)、特异性、引物序列互补问题、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3'-末端序列等。
(1)引物长度:由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联,因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。
(2)溶解温度(Tm):因加热而断开H键,使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。
Tm可采用下列公式计算:Tm=2(A+T) + 4(G+C)。 需注意PCR反应至少有两个(一对)引物,两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近,不可差异过大。
因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配,而引物Tm值较低,反应温度较高时则可能不能发生作用,因此如引物的Tm值差异较大,可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。 (3)引物序列互补:设计引物时应绝对没有3个碱基以上的内引物配对,如引物有这样具有自我配对的区域,“弹回”即部分双链结构将发生在退火反应时。
(4)G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸:待选择的引物序列应尽可能是碱基随意分布,G+C含量平均-避免长A+T和富含G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量一般为45%-55%。
在选择的引物序列中应没有多G 或多C延伸,因其可促进非特异性退火,多A 和多T延伸也应避免,因其可“呼吸”和使引物-模板复合物展开延伸,降低扩增的效率。同时多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也应被避免。
(5)3'-末端序列:为控制引物错配,应认真地确定PCR引物中3'末端的位置。 总而言之,应重视PCR引物设计,设计PCR引物时应认真小心。
对于一个成功的PCR来说,几个重要因素如引物长度、GC含量和3'序列必须优化。理想的引物应为差不多随意分布的核苷酸混合、GC含量50%、长度约为20个碱基,因此能使Tm值处于56-62ºC范围。
分析靶基因潜在引物位点时,应考虑无单聚合体, 没有明显的二级结构形成的倾向,不自我互补,与其他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味的设计,节省时间,减少错误,可应用计算机程序优化设计、选择、确定寡核苷酸引物。
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