细菌重组质粒的转化(重组质粒构建的注意事项)

1.重组质粒构建的注意事项

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下：

1） 克隆基因的酶切位点问题

2） 载体酶切的问题

3） 连接片段浓度比的问题

在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。

一、克隆基因的酶切位点问题

1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。

2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

2.关于质粒转化

1.电击转化时通过瞬时高压使细胞表面出现微小的孔洞，从而使外源DNA能通过孔洞进入到细胞里面，一般适用于革兰氏阳性细菌或者真核微生物；

热激转化是使用钙盐或者镁盐溶液在低温状态下处理细胞使其处于感受态状态，然后通过短时热激使其吸入外源DNA片段，主要应用于革兰氏阴性细菌。

这些我想你应该懂的。我就不赘述了。

2.大肠杆菌作为革兰氏阴性细菌，使用一般的化学转化即热激转化就可以了，为何要劳神费力使用电转化？转化的目的不就是简单而方便为原则么？正所谓杀鸡焉用牛刀？

希望我的回答对你有帮助。