原位杂交(原位杂交的原位杂交试验)
1.原位杂交的原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。
或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成） 1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。2） 置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。
发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
2. 预杂交1）每个管中置换成大约300ulHYB-溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。2）用等体积的HYB+取代HYB-。
3)60℃水浴，预杂交4小时以上。3. 杂交1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..2)60℃ 温浴过夜。
注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。 1.1）将探针回收，放于-20C保存（通常探针可重复使用十次左右）。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。3）置换2XSSCT1ml,60℃，放置15分钟。
4）置换0.2XSSCT1ml,60℃，放置30分钟，重复一次。2.1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。
2）室温下加1ml 1:2:7溶液，时间为一小时。3）按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。
1） 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6)4C冰箱保存。原位杂交中溶液的配制：PBS:NaCl 8gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24gDEPC H2O 1LHCl 调PH值至7.4抽滤，灭菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40gPBS 1L加热持续搅拌至溶液澄清。
-20℃保存PBST:PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2gNaCl 175.5gDEPC H2O 至1L抽滤，灭菌SSCT:SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。
HYB-：甲酰胺：20XSSC储液：DEPC水=2:1:1配制加入Tween-20使其终浓度为0.1%,-20c保存。HYB+:HYB- 20mlyeast RNA 10mgheparin 1mg。
-20℃保存。MAB:maleic acid 11.6gNaCl 8.8g用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.54℃保存MABTMAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8gMAB 72ml1:2:7溶液：灭活羊血清：10% BM blocking reagent:MABT=1:2:7用时现配Staining buffer:Tris 12.1gpH9.5Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85gTween-20 1ml，用之前加1M的左旋咪唑储液，使之终浓度为1mM。
2.原位杂交的主要程序
1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天
1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；
3) 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；
4) PBS清洗3分钟；
5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6) PBS清洗10分钟；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育15分钟；
8) PBS清洗2次，每次3分钟；
9) 0.2N的HCl孵育30分钟；
10)PBS清洗2次，每次3分钟；
11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12)PBS清洗2次，每次5分钟；
13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；
15）杂交；第二天
16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；
17)PBS清洗3分钟；
18)RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；
19)PBS清洗5分钟；
20）室温，2*SSC清洗10分钟；
21)37℃，1*SSC清洗10分钟；
22)37℃，0.5*SSC清洗10分钟；
23）缓冲液A孵育10分钟；
24）缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；
25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim）,37℃孵育3 小时；
26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；
27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；
29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
30）固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天
1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；
2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；
3) 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；
4) PBS清洗5分钟；
5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；
6) PBS清洗5分钟；
7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟；
8) PBS清洗2次，每次5分钟；
9) 0.2N的HCl孵育30分钟；
10)PBS清洗2次，每次5分钟；
11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
12)PBS清洗5分钟；
13）预杂交缓冲液孵育30分钟；
14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；
15）杂交；第二天
16）将玻片置于SSC中以去除封片；
17）室温，2*SSC清洗10分钟；
18)37℃，1*SSC清洗10分钟；
19)37℃，0.5*SSC清洗10分钟；
20）缓冲液A孵育10分钟；
21）缓冲液A孵育30分钟；
22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；
23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；
24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；
25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；
26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；
27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
3.原位杂交的介绍
原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。原位杂交可以在细胞标本或组织标本上进行。另有荧光原位杂交。
4.原位杂交的原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。
或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成） 1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分钟。2） 置换成30%甲醇的PBST溶液，放置5分钟3） 置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次4） 置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。
发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。2） 用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。
3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。4） 用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。
2. 预杂交1）每个管中置换成大约300ulHYB-溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。2）用等体积的HYB+取代HYB-。
3)60℃水浴，预杂交4小时以上。3. 杂交1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..2)60℃ 温浴过夜。
注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。 1.1）将探针回收，放于-20C保存（通常探针可重复使用十次左右）。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分钟，重复一次。3）置换2XSSCT1ml,60℃，放置15分钟。
4）置换0.2XSSCT1ml,60℃，放置30分钟，重复一次。2.1）用MABT洗两次，每次五分钟，放在摇床轻轻摇动。
2）室温下加1ml 1:2:7溶液，时间为一小时。3）按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连地高辛抗体，4C 冰箱过夜。
1） 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液，放置摇床上25分钟，然后用1mlMABT置换，25分钟，再用1mlMABT溶液置换，一小时以上，最后用1mlMABT溶液置换，25分钟。2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分钟。
3）将胚胎转入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上锡箔纸以避光，避免摇动，室温下显色。4）每隔一小时观察胚胎是否开始显色5）将显色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。
6)4C冰箱保存。原位杂交中溶液的配制：PBS:NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g DEPC H2O 1L HCl 调PH值至7.4 抽滤，灭菌4% 多聚甲醛：多聚甲醛 40g PBS 1L 加热持续搅拌至溶液澄清。
-20℃保存 PBST:PBS溶液加上Tween-20使其终浓度为0.1%。20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽滤，灭菌 SSCT:SSC加上Tween-20使其终浓度为0.1%。
HYB-：甲酰胺：20XSSC储液：DEPC水=2:1:1配制 加入Tween-20使其终浓度为0.1%,-20c保存。HYB+:HYB- 20ml yeast RNA 10mg heparin 1mg。
-20℃保存。MAB:maleic acid 11.6g NaCl 8.8g 用固体NaOH（约7g）调至Ph=7.54℃保存 MABT MAB加上Tween-20使其终浓度为0.1%.10% blocking reagent:blocking reagent 8g MAB 72ml1:2:7溶液：灭活羊血清：10% BM blocking reagent:MABT=1:2:7 用时现配 Staining buffer:Tris 12.1g pH9.5 Mgcl 6H2O 10.2g,Nacl 5.85g Tween-20 1ml，用之前加1M的左旋咪唑储液，使之终浓度为1mM。
5.谁知道原位杂交怎么做
原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为in situ hybridization，其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT,CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。该技术最早应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。
原位杂交（In situ hybridazation）
固定
收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用（两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成）
6.RNA荧光原位杂交
原位杂交：在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。
其基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子的特点，应带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DAN或 RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸。（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定位；用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。
此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学。
