单孢分离法的(黑木耳的分离单孢方法是什么?)

1.黑木耳的分离单孢方法是什么?

分离单孢的方法很多，有平板稀释法、平板划线分离法、稀释涂布法、液滴分离法、毛细管分离法等。

我们采用的是平 板稀释法，即将收集到的木耳孢子用无菌水稀释至合适浓度， 将孢子悬液接入平皿中培养，待孢子萌发后挑取大量单菌落， 接入马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养基中插有盖玻片。菌丝萌 发后取出玻片一一镜检，将无锁状联合的单核菌丝编上号作 杂交材料。

将两个不同亲本经镜检无锁状联合的单核菌丝A, B分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管的上下部，待两 单核菌丝生长相遇时，取连接处的一小块菌丝（经镜检有锁状 联合者即为杂交菌丝C）接种于另一空白培养基试管中央，在 它的上下部分别接两个亲本菌丝A和B，观察杂交菌丝C与 亲本菌丝A,B有无拮抗线。如有明显的拮抗线，即表示该配 对为杂交菌丝，则保留；没有拮抗线而长到一起的不是杂交菌 丝，则淘汰。

2.草菇单孢分离法育种方法是什么?

单孢分离是一种可以获得纯菌种的方法，主要就是将采集到的孢子群分开培养，让它们单独萌发成菌丝。

通过对草菇进行有性分离育种，然后选育出草菇菌株。表明草菇的孢子分离菌株，不管是在菌丝形态，还是生长速度和产厚垣孢子的能力方面，以及出菇率和产量等性状上都存在比较大的差异。

我们可以在菌丝生长比较浓密的地方及能产生大量厚垣孢子的菌株中，选择到产量较高的菌株在生产中应用，可以在一定程度上解决草菇生产上出现的菌种老化、退化问题。单孢分离法主要的步骤：菇种的选择首先是对藤种进行选择，并进行一系列的消毒处理。

努力收集质量比较好的单孢子。 单孢子的分离和涂布选择一种适合自己的方法获得单孢子，并对单孢子进行分离，单孢子的分离可采用单孢子分离器法和平板划线分离法。

然后进行孢子涂布，在灭菌培养基上把获得的单孢子均匀涂开。单孢子培养在保持温度大约在35℃-40℃恒温下，把单孢子培养至长成纯菌丝，然后按可育性菌株的培养特征，把符合条件的菌株留作母种。

扩大母种把培养好的单孢子扩大培养成原种和生产种。出菇测验把母种培养成原种和生产种后，就要开始对出菇进行试验，经过初筛和复筛，把出菇早、出菇均匀、粒大、菇形好、产量高的菌种筛选保留。

选择一小块试验田进行试种，检验出菇率的稳定性。小面积试种成功后，就可扩大实验田的面积，继续进行出菇率的确认。

最后就是把经过确认的菇种，大面积推广应用。

3.菌种孢子分离应怎样操作

孢子分离为有性繁殖，所获菌种已经发生遗传重组等变 异，生产性状有可能优于母体，也有可能劣于母体。

孢子分 离有单孢分离和多孢分离两种方法，单孢分离主要用于遗传育种研究，多孢分离多用于生产繁种。孢子分离技术如下：悬菇弹孢法：采集刚弹射孢子的子实体菌盖，在无菌室经消毒处理 后，将菌褶朝下悬吊于无菌容器内收集孢子，在22度〜26°度 下让其自然弹射孢子5〜10小时，容器底部出现白色孢子 印。

取无菌水粘取少量孢子制成孢子悬浮液，用灭过菌的注射器或滴管吸取孢子悬浮液，滴1〜2滴于试管斜面上，经 25°度培养至孢子萌发，挑选无污染的斜面进行扩繁，经过严 格的出菇试验，择优用于生产。褶片粘贴法：在无菌条件下，选取一小块子实体组织，蘸少量无菌琼 脂或浆糊，粘附于试管培养基斜面的对面玻壁上，加棉塞后 在20度左右静置，菌孔组织中的孢子会弹射到斜面培养基 上，再去掉试管壁上的菌块，进一步培养获得多孢子萌发的 菌丝体。

4.什么是孢子分离法

孢子分离法也称为孢子弹射分离法，是利用某些药用真菌子实体成熟后自行弹射孢子的特性，在无菌条件下，使弹射的孢子落到适宜培养基上，在适宜条件下进行培养，孢子萌发成菌丝，从而获得纯菌种的一种方法。

（1） 分离材料的选择与消毒孢子分离材料，来自于多年人工栽培的优良品系和野生的种菇。 在同一个生长条件下，栽培同一种药用真菌不同的品系，其生产效益和品质有很大差异；而同一个品系栽培在不同的环境条件下，其优良性状表现也不同，就是在相同环境条件下栽培的同一个品系，其单株之间也会出现差异。

因此，应选择长期栽培的优良品种的优良单株作为分离材料。 野生的菌株，未经过人工栽培，不知其优良性状、抗逆能力和生产性能如何，只能作为育种搜集原始材料时进行孢子分离，经过培养品系之间对比试验，选择优良者进行生产，在选优去劣的培养过程中，再在群体中选择优良个体，作为孢子分离的材料。

理想的种菇应该是具有该品种主要典型的特征，发育正常，个体健壮，无病虫害，成熟适度的子实体。 种菇选定后，可将其周围 10厘米左右范围内的小菇全部摘除，适当增加喷水量，有的药用真菌子实体有菌幕包着，即可待种菇有八、九分成熟时，及时采摘进行消毒。

可剪去菌柄的三分之二，用清水洗去黏附的污物，浸入0。 1%的升汞溶液中1~2分钟或在70%的酒精中浸几秒到1分钟，取出后用无菌水反复冲洗数次，用灭菌的纱布或滤纸吸干表面水分后待用。

有些药用菌如香菇的子实体，很小时菌幕就被拉开；或有的种类根本无菌幕，菌褶裸露于空气中，很难避免有杂菌孢子附着在菌褶上，则应采摘成熟的子实体，剪去三分之二的菌柄，用 75%的酒精揩擦菌盖及菌柄表面，并在插人孢子收集器后6~12小时内，种菇孢子已弹出而附在上面的杂菌孢子短时间内还未脱落时取出子实体。 而对于胶质菌类的子实体，只能用无菌水洗涤，用无菌纱布吸干表面水分后待用。

（2） 孢子的采集种菇经消毒处理后，即可采用以下方法收集孢子。孢子弹射采集法：利用孢子自动弹射出子实层的特性，采集孢子。

一般采用整株插种法、三角瓶钩悬法和试管贴附法，全部操作过程都应该在无菌条件下进行。 ① 整株插种法：适于伞菌类孢子的采集。

首先应准备好孢子采集器，用搪瓷盘或大于钟罩的培养皿作底盘，上面放一个小培养皿，皿内放一个不锈钢的支架，用钟罩盖在小培养皿上，将整套孢子采集器用双层纱布或报纸包好，经高压灭菌后备用。在无菌条件下打开孢子采集器，揭去钟罩，为了防止钟罩与培养皿接触处杂菌侵人和增加采集器内部的湿度，在大培养皿内铺 2~3层灭菌的纱布或脱脂棉，倒人0。

1 %的升汞液，以浸湿纱布为度，然后放人小培养皿，将消毒后的子实体插在支架上盖钟罩后，根据不同分离对象，移至18~25°C条件下，培养6小时至2天，待小皿内弹射并沉积一层孢子后，移入无菌室，先用75%的酒精或0。1%升汞擦拭钟罩外部，打开钟罩取出子实体，小培养皿加盖密封，供分离用。

② 三角瓶钩悬法：适用于不具菌柄子实体孢子的采集，如胶质菌银耳、木耳等。在无菌条件下，将耳片用无菌水冲洗数次后，用无菌纱布吸干水分，将耳片挂在金属钩上，钩子的另一端挂在三角瓶口上，瓶内装有PDA培养基，加棉塞，置25°C温度下培养 1~2天，当培养基表面有一层孢子粉时，把三角瓶拿到无菌室取出耳片和钩子，仍塞好棉塞继续培养。

③ 贴附法：取一块经消毒的成熟菌褶或耳片，用灭菌的琼脂或浆糊，黏附在装有PDA培养基的试管斜面或培养皿皿盖正上方，加棉塞或盖皿盖后置室温下培养，待孢子自然落下后，在无菌室内慑除菌褶或耳片，或将落有孢子的培养基转移在新的试管斜面及培养皿平板培养基上，加塞或加盖后继续培养。 ④ 孢子印采集法：取成熟的子实体经表面消毒后，切去菌柄，置于灭过菌的白色或黑色蜡光纸上，罩上通气钟罩，在24°C下静置数小时后，轻轻移去种菇，可见有大量孢子落在纸上。

将有孢子印的纸在无菌条件下保存备用。⑤ 菌褶涂抹法：在接种室内，将成熟的子实体表面消毒，去掉菌柄，用消毒的接菌环插入两片菌褶之间，轻轻涂抹褶片，将尚未弹射的孢子沾在接种环上，然后用划线法接种在准备好的斜面培养基上或平板培养基上。

操作时，要严格在无菌条件下，动作要准确。⑥ 空中孢子捕捉法：伞菌子实体成熟后，孢子大量弹射，在子实体周围可见烟雾状的“孢子云”，将准备好的培养基平板或试管口迎着“孢子云”方向，使孢子附着在培养基表面，随即盖上皿盖或加棉塞即可。

（3） 孢子的分离采集到的孢子，一般需要经过分离选择后，才能制作原种。 孢子的分离根据接种到培养基上的孢子数量而分单孢分离和多孢分离两种。

有些菇类的孢子，具有单孢结菇的能力，可采用单孢分离纯菌种的方法；有些种类如香菇、木耳、金针菇等药用真菌的单孢菌丝，只有经过质配后才能结菇，多采用多孢分离法，多孢分离方法简单、易操作、没有不孕现象，在生产上常采用；但不能选择优良单孢繁殖后代，如果进行杂交育种时，仍应进行单孢分离。 单孢分离：从采集到的孢子群中，挑出单个孢子进行培养，单。